無(wú)血清培養(yǎng)基的知識(shí)與應(yīng)用

1、基本介紹

無(wú)血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，既能滿足細(xì)胞在體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的要求，又能避免動(dòng)物血清所帶來(lái)的不利因素。無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷程一般分為無(wú)血清培養(yǎng)基（Serum-Free Medium，SFM）、無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基（Animal Component Free Medium，ACFM）、無(wú)蛋白培養(yǎng)基（Protein-Free Medium，PFM）及化學(xué)成分限定培養(yǎng)基（Chemically Defined Medium，CDM）等四類。這里所提到的主要指第一類無(wú)血清培養(yǎng)基。

在使用無(wú)血清培養(yǎng)基時(shí)，有些細(xì)胞需要逐漸適應(yīng)，即先將原來(lái)的培養(yǎng)基與無(wú)血清培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，漸漸地再轉(zhuǎn)為*的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。有些貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，復(fù)蘇時(shí)也可用少量的血清先培養(yǎng)，因?yàn)檠蹇芍?xì)胞貼壁，然后再換成無(wú)血清培養(yǎng)基。

2、主要成分

無(wú)血清培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)較*的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充因子組成。

2.1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基

在不同細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)細(xì)胞需求對(duì)成分已知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整即可使細(xì)胞更好地生長(zhǎng)并提高目的產(chǎn)物的表達(dá)量。大多數(shù)人工合成的培養(yǎng)基如DMEM、DMEM/F12、1640

2.2、主要補(bǔ)充因子

補(bǔ)充因子是代替血清的各種因子的總稱。多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)液必須補(bǔ)加3-8種因子。胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白是必須補(bǔ)充因子，其他多數(shù)為輔助作用的因子。按其功能不同，補(bǔ)充因子可分為五類：

• 激素和生長(zhǎng)因子。很多細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)需要加入激素，如胰島素、生長(zhǎng)激素、胰高糖素等。胰島素是重要的細(xì)胞存活因子，與細(xì)胞上的胰島素受體結(jié)合后可促進(jìn)RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細(xì)胞凋亡。此外，雌二醇、孕酮等也是無(wú)血清培養(yǎng)基中常添加的補(bǔ)充因子。

• 結(jié)合蛋白。常見(jiàn)如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白與細(xì)胞上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合是細(xì)胞獲取鐵元素的主要來(lái)源。白蛋白與脂類、激素、維生素、金屬離子和生長(zhǎng)因子結(jié)合后可調(diào)節(jié)上述物質(zhì)在無(wú)血清培養(yǎng)基中活性的作用，此外，由于牛血清白蛋白一般添加量比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。

• 貼壁因子。許多細(xì)胞必須貼壁才能生長(zhǎng)，這種情況下無(wú)血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖粘連蛋白、膠原蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對(duì)許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖粘連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。

• 酶抑制劑。培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無(wú)血清培養(yǎng)基中不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。常用的是大豆胰酶抑制劑。

• 其他補(bǔ)充因子。一些細(xì)胞培養(yǎng)使用的無(wú)血清培養(yǎng)基還需要補(bǔ)充微量元素、維生素、脂類等低分子量物質(zhì)。

3、優(yōu)缺點(diǎn)

3.1、優(yōu)點(diǎn)

1）避免血清不同批次間的質(zhì)量差異，提高細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性；

2）避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染；

3）避免血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響；

4）有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化；

5）可提高目的蛋白的表達(dá)量并使產(chǎn)品易于分離純化；

6）組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)；

7）不含有絲分裂原抑制劑，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。

3.2、缺點(diǎn)

1）細(xì)胞易受某些機(jī)械和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便；

2）成本高；

3）針對(duì)性很強(qiáng)，一種無(wú)血清培養(yǎng)基僅適合某一類細(xì)胞的培養(yǎng)；

4）不同細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)及營(yíng)養(yǎng)成分的需求不同；

5）雖然不添加動(dòng)物血清，但為了細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中依然包含大量動(dòng)植物來(lái)源蛋白，添加物質(zhì)的化學(xué)成分也不夠明確。

4、應(yīng)用

4.1、生產(chǎn)生物制品

目前，生產(chǎn)生物活性蛋白、疫苗、單克隆抗體和基因治療藥物的表達(dá)載體等生物制品時(shí)一般都采用可高密度生長(zhǎng)的動(dòng)物工程細(xì)胞。無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)的運(yùn)用，給動(dòng)物工程細(xì)胞提供了更優(yōu)的條件，進(jìn)而表達(dá)更多的目的產(chǎn)物，并有利于后續(xù)目的產(chǎn)物的分離和純化。

4.2、基礎(chǔ)研究領(lǐng)域

雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合。如，在利用DC腫瘤疫苗治療時(shí)，所需要的樹(shù)突狀細(xì)胞和用于抗原致敏的腫瘤細(xì)胞，往往在胎牛血清（Fetal Calf Serum，F(xiàn)CS）中進(jìn)行培養(yǎng)，這使得很難分辨哪些免疫應(yīng)答是由血清引起而非真正的先天免疫系統(tǒng)的作用，需要使用成分明確的無(wú)血清培養(yǎng)基排除動(dòng)物血清的干擾。