如何進行細胞凍存與復(fù)蘇？

為什么要進行細胞凍存？

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。

除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑--終濃度5%.15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，細胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。 

采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細胞存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。

細胞凍存的步驟

（1）選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為5×10⁶～1×10⁷/mL之間。
（3）將分裝上述細胞懸液于2ml凍存管中，每管0.25ml。凍存管要將蓋子蓋緊，并標(biāo)記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數(shù)）。
（4）將裝好細胞的凍存管放到凍存盒中，-80℃冰箱過夜。；如果有程序降溫器(放在-80℃冰箱過夜，放入液氮罐)最好;或者可以在4℃，2h;然后轉(zhuǎn)到-20℃，2h;-80℃，2h;放入液氮罐。
（5）細胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，最好取出一只凍存管細胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。

如何進行細胞復(fù)蘇

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻;

3. 離心， 1000rpm，5min;

4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。